科瑞斯别藻蓝蛋白抗体标记方案

2022/11/7 8:33:42

一、别藻蓝蛋白简介

别藻蓝蛋白(APC)是从螺旋藻中分离的藻胆蛋白。与其他藻胆蛋白一样,别藻蓝蛋白是具有极高的吸收率和高量子效率的荧光物质。它是一种蛋白质,通过常规蛋白质交联技术可以很容易地与抗体和其他蛋白质连接,而不会改变其光谱特征。别藻蓝蛋白在主要的藻胆蛋白中是不稳定的,在低浓度下(包括某些实验浓度)易于解离。别藻蓝蛋白偶联物通常用于流式分析、基因芯片和ELISA实验,由于光淬灭特别快,很少用于荧光显微镜检测。

二、试验材料

别藻蓝蛋白染料 ;PD-10柱(葡聚糖凝胶层析柱 Sephadex G-25M) ,Cytiva 公司产品,产品目录号 No. 17-0851-01;NAP5 柱(葡聚糖凝胶层析柱 Sephadex G-25 DNA grade), Cytiva公司产品,产品目录号 No 17-0853-02;琥珀酰亚胺-4-(N- 甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC),Thermo公司,产品目录号 No.22360;N-乙基马来酰胺(NEM),Thermo公司,产品目录号No.23030 ;二甲基亚砜(DMSO),Thermo 公司,产品目录号 No. D12345。

三、试验方法

1、别藻蓝蛋白的衍生化

①将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)配制成 10 毫克/毫升的母液,APC与琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯) (SMCC)交联摩尔比1:20,铝箔封好后于室温旋转反应 60 分钟,使APC分子上的氨基与琥珀酰胺反应发生衍生化。

②交换缓冲液预先平衡凝胶层析柱,将衍生化的APC过柱,收集蛋白峰。

2、抗体的处理

①二硫苏糖醇(DTT)溶解于蒸馏水中,配制成 1 摩尔/升的二硫苏糖醇(DTT)母液,调整抗体的浓度,使其浓度至少为 4 毫克/毫升。

②每毫升抗体溶液中加入 20 微升的二硫苏糖醇(DTT)母液,室温静置反应 30 分钟,将抗体的二硫键打开形成巯基。

③交换缓冲液预先平衡凝胶柱,将反应液过柱,收集抗体部分。

3、别藻蓝蛋白和抗体的共价交联

①每毫克抗体加入 1.5 毫克的琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)衍生化的APC,铝箔封好后于室温旋转反应 60 分钟,使马来酰亚胺基和抗体上的巯基实现共价交联。(注:浓度需进行梯度测试,染料建议浓度4mg/mL)

②10 毫克的 N-乙基马来酰胺(NEM)溶解于 1.0 毫升的无水二甲基亚砜(DMSO)中制成 N-乙基马来酰胺(NEM)母液(现配现用)。

③每毫克抗体中加入 3.4 微升N-乙基马来酰胺(NEM)母液,铝箔封好后于室温旋转反应 60 分钟, 反应后,使抗体上的巯基封闭。

4、交联物的存储

将交联物于存储缓冲液中透析后保存于2-8℃。

四、交联别藻蓝蛋白

由于天然提取的别藻蓝蛋白在稀释溶液(低浓度)或暴露于促溶盐环境中会水解,因此,通常对别藻蓝蛋白进行交联处理,从而使其在生物反应体系内保持稳定。利用化学方法对天然藻蓝蛋白进行处理,在α和β亚基之间发生化学交联,可以得到交联别藻蓝蛋白,即CL-APC。CL-APC比APC稳定得多不仅增强产品的稳定性,同时保留天然染料的荧光和光谱完整性。交联别藻蓝蛋白的抗体标记方案与别藻蓝蛋白一致,标记后有更高的荧光强度。

科瑞斯生物可提供别藻蓝蛋白(APC)及更加稳定的交联别藻蓝蛋白(Cl-APC),供客户选择。也可以提供已衍生化的别藻蓝蛋白,可减少实验步骤。

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