一、 荧光蛋白

1. 蛋白质结构编码了荧光。这些荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、YFP、RFP和各种衍生物。

（1） 荧光蛋白始祖——绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，基于GFP晶体结构，通过定点或随机突变手段以期找到功能更强的GFP突变体。应用范围最广的当属增强型GFP(EGFP)）和Emerald(祖母绿)，不稳定增强型绿色荧光蛋白(dEGFP)，增强型黄色荧光蛋白(EYFP)，增强型蓝色荧光蛋白（EBFP)，增强型蓝绿色（青色）荧光蛋白(ECFP)等各种衍生型GFP，发出的荧光颜色各不相同。

（2） 红色荧光蛋白

GFP虽然用途广泛，但由于其发射光谱仅局限于440-529 nm,细胞内成像时背景较高,无法对活体生物皮下进行更深的荧光标记。与GFP相比，其激发和发射波长更长，在细胞内成像时背景低，并且红色荧光蛋白能够与GFP共同标记。

早用于研究的红色荧光蛋白是DsRed(发射峰在583nm)，来源于珊瑚，荧光强、稳定性好。DsRed易形成寡聚体，且成熟速度慢，DsRed的突变体有mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry和mCherry，其中mStrawberry和mCherry，发射峰分别为596nm和610nm，亮度分别为EGFP的75%和50%左右。

2. 衍生自在藻类和植物中发现的藻胆蛋白

这些蛋白质使用藻胆蛋白辅因子来吸收光能，包括藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)和紫草素叶绿素(PerCP)。

特点:

具有较大的斯托克斯位移(75-200 nm)，并且具有稳定的发射光谱。 由于藻胆蛋白较大，因此它们在结合过程中通常具有1∶1的蛋白质与荧光染料比率，因此对于定量流式细胞术非常有用。易受光致漂白，不建议长时间或反复暴露于激发光源中。

二、 有机小分子

FITC(分子量389 Da) 、Alexa Fluor 488(FITC类似物，分子量643 Da) 、Texas Red(TMRed，分子量625 Da) 、Alexa Fluor647(分子量1155 Da) 、 Pacific Blue (分子量242 Da）和Cy5(分子量762 Da）等

特点:

具有一致的发射光谱和较小的斯托克斯位移（激发波长和发射波长之间的差，大约为50-100 nm)光稳定好，容易与抗体偶联，应用广泛。

三、 量子点

QDot是一种半导体，可以根据粒子的尺寸调整其不同的发射波长。

五种不同的量子点探针溶液显示为用相同的长波长UV灯激发；探针的大小决定颜色。 Qdot探针是纳米级(大约为蛋白质大小)的原子簇，包含数百至几千个原子的半导体材料(镉与硒或磅混合)，该材料已被另外的半导体壳（硫化锌）覆盖）以改善材料的光学性能。这些粒子发荧光的方式与传统荧光团完全不同，而没有电子跃迁的参与。

特点:

亮度高、光稳定性好。

QDots通常被紫激光激发，由于这些补偿问题难以解决，并且将Qdot结合到抗体上较为困难，所以这些试剂在多参数方案中大多被高分子染料取代。

四、 聚合物染料

Brilliant Violet(BV)、Brilliant Ultraviolet(BUV)和Brilliant Blue (BB)。

特点:

染料由收集光信号的聚合物链组成，可以根据聚合物链的长度和连接的分子亚基，“调节”吸收和发射特定波长的光。这些染料非常稳定，与藻胆蛋白具有相似的量子效率，光稳定性大大提高。

仅吸收特定波长的光，因此避免了Qdots存在的跨波长激发的问题。

五、 重金属离子

适用于质谱流式分析，不是用荧光素结合的，而是与镧系元素系列中的单个同位素重金属离子结合。

目前商业上有35种镧系金属可用于抗体偶联。

六、 串联染料

串联染料是利用Forster共振能量转移（称为FRET或荧光共振能量转移）原理的特殊类别的荧光分子。串联染料（或荧光团)由两个共价连接的荧光分子组成。一个用作供体分子，而另一个用作受体。这产生了具有供体分子的激发和受体的发射性质的独特荧光团。

特点:

串联染料非常亮，具有较大的斯托克斯位移值(150-300 nm)，检测低密度的抗原时非常有用。串联染料的稳定性不如供体荧光染料，并且能量转移效率因批次而异，使补偿复杂化。

注:串联染料非常敏感和容易降解。这导致受体发射光损失和供体发射光增强，特别是如果荧光团使用相同激光器激发。例如，如果使用PE和PE-Cy7，并且PE-Cy7荧光团开始降解，则其发射的光将在PE通道中检测到，从而给导致错误的数据。串联染料降解的主要原因之一（除了氧自由基)是暴露于光–这是完全可预防的!所以，当染色细胞时，避免曝光或处于极端的温度变化环境。后一种建议的原因是某些串联染料可能易受细胞介导的解耦影响，因此在低温下减慢细胞代谢可有助于保持稳定性。

七、 核酸染料

核酸染料DAPI可嵌入到DNA双螺旋中。

核酸荧光染料对细胞核染色后定量测量细胞所发出的荧光强度，就可以确定细胞核中DNA、RNA的含量，并可以对细胞周期(如PI，7-AAD， Dyelycle Violet, DAPI)和细胞的增殖状况进行分析，分选染色体(如Hoescht 33342,Chromomycin A3)，利用侧群分析对干细胞进行分选（如Hoescht 33342)，死活细胞区分以及对细菌进行分选。。有多种荧光染料可以对细胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst 33342等，RNA染料有噻唑橙、叶啶橙等。

八、 细胞增殖染料

用BrdU（(溴脱氧尿咤啶核苷）孵育细胞，使其掺入细胞DNA合成过程，然后用针对BrdU的抗体和DNA染料染色，便可测量细胞增殖。但是，此方法不适合长期增殖研究。

羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)可用于跟踪增殖细胞的多次分裂。在合适的浓度下，不影响细胞生长或形态，适合长期增殖研究。

九、 细胞死活染料

细胞活力可以通过排除性染料(如碘化丙啶、DAPI)确定，染料不能固定，仅适用于无感染性且需立即分析的细胞。也可通过染料与细胞内胺类物质的结合检测，胺类染料包括Live/Dead (ThermoFisher)，Zombie (Biolegend)或Fixable Viablity (BD Biosciences)，适用于固定的细胞，适合有传染性细胞、胞内抗原染色的细胞、多聚甲醛固定的细胞。

十、 钙指示剂染料

钙指示剂染料与钙结合后会发生色移，可用于指示细胞激活和信号传导。

常用的染料仍然是indo-1，即紫外双相钙探针。另外还有fluo-3的Blue-green calcium probes。